南湖新闻网讯（通讯员 孙琳）11月30日，华中农业大学棉花遗传育种团队在ADVANCED SCIENCE在线发表了题为“Construction of Host Plant Insect-Resistance Mutant Library by High-Throughput CRISPR/Cas9 System and Identification of A Broad-Spectrum Insect Resistance Gene”的研究性论文。

棉花是主要经济作物，棉纤维是全球领先的纺织原料。随着转基因棉花的广泛采用，编码苏云金芽孢杆菌（BT）毒素的Cry基因已成功控制两种主要的鳞翅目害虫：棉铃虫和红铃虫。然而，目前商业化的转基因BT棉(Cry IAc/Ab)对大多数刺吸式口器昆虫，如粉虱、蚜虫、盲蝽等没有杀虫作用。近年来，刺吸式害虫已成为我国棉田最具破坏性的害虫。根据新疆棉花科研机构2019年的报告，我国棉花主产区-新疆棉区棉田受蚜虫侵害44.2万公顷，约占新疆地区棉花种植面积的20%左右。鉴定棉花抗虫内源基因、开发基因工程新工具具有重要意义，是我国抗虫棉升级的必由途径。因此，棉花功能基因组学需要一种有效且可靠的基因高通量功能分析策略。

功能基因组学研究依赖于大量突变体的筛选；然而，低自然突变率无法满足研究进展的需要。一些传统的实验方法用于植物诱变育种，如物理辐射和化学诱变技术。此外，农杆菌介导的 T-DNA 整合策略彻底改变了植物功能基因组学，通过提供丰富的突变体资源来鉴定基因功能并将许多植物物种的基因型与表型联系起来。然而，T-DNA 插入是随机插入到基因组中的，并且经常整合到基因间或非编码区域中，这可能会产生无法检测到的表型。由于基因冗余，这种现象主要存在于多倍体植物物种中。因此，为具有复杂基因组的多倍体植物物种创建大型或基因组规模的功能丧失突变库是一项艰巨的任务。

近年来，成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）已成为功能基因组学的强大且通用的工具。目前，CRISPR/Cas9系统已成功应用于主要农作物。在棉花中，华中农业大学棉花遗传改良团队建立了多个高效、精准的CRISPR/Cas系统，能够实现对靶标位点的敲除、敲入、敲高、敲低及SNP点突变（Plant Biotechnology Journal, 2018, 2019, 2020, 2021; BMC Biology, 2022; Plant Communications, 2023）。由于其高效能力，CRISPR/Cas9 系统已被用来生成大规模突变体文库，并已成为人类和动物细胞培养中的常用技术。然而，由于遗传转化过程需要大量的人力和时间，因此关于植物高通量 CRISPR/Cas9 筛选的报道很少。基于前期在棉花中建立的高效遗传转化和基因编辑系统，使得我们在棉花中建立的 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统使建立用于棉花基因组学研究的大规模突变体库成为可能。

我们利用CRISPR/Cas9系统设计了968个sgRNA靶向502个前期通过多重组学鉴定的可能参与棉花抗虫调控的基因（Li et al., Plant Biotechnology Journal,2 016; Li et al., IJMS, 2019; Si et al., Crop Journal, 2020），并快速生成一个约2000株再生植株的高覆盖度突变库。通过高通量测序分析，发现T0代突变体发生基因组编辑的概率达到97.29%，基因组编辑位点平均遗传力高达84.78%。对200个株系进行抗虫测定发现有超过10%的基因突变体材料表现出对虫害的抗性改变。表明针对特定性状构建高通量突变体库进行特定性状表型筛选是一种高效的候选基因筛选策略。

图1 

为了筛选潜在的棉花宿主昆虫抗性基因，进行了昆虫生物测定，以研究编辑株系对昆虫侵染的反应。总共 200 个针对 133 个基因的独立 T1 株系被用于温室和田间条件下的昆虫生物测定。首先，T1代植物在温室中用蚜虫生测实验，而T2代植物在田间条件下进行验证。在温室和田间实验中，有 10 个株系对蚜虫侵染有显著反应。其中，有两个株系对蚜虫侵染具有较高的抗性，且蚜虫数量明显低于对照植物。另一方面，其他8株系上的蚜虫数量显着高于对照植物，表明对蚜虫的易感性增加。

图2

进一步实验发现，这两个株系CR-139和CR-144）检测到相同的针对GhMLP423基因的sgRNA，并且在这两个系中都被成功敲除。有趣的是，这两个品系都对刺吸式口器昆虫和咀嚼式口器昆虫表现出高度敏感，表明GhMLP423可能在棉花抗虫害方面发挥重要作用，因此我们选择它进行进一步研究。以了解其在棉花进化过程中抗虫性中的作用。

图3

研究人员针对抗虫性显著下降的GhMLP423基因敲除突变体材料进行了深入研究。实验结果发现GhMLP423与EPS15发生互作，GhEPS15 正向调节植物防御信号。

图4

进一步实验发现植物受到昆虫取食时，GhMLP423响应昆虫取食信号，诱导GhEPS15调节Ca2+信号，进一步诱导ROS爆发，这激活了SA和PR相关基因来抵御昆虫取食。

图5

综上所述，研究结果表明，GhMLP423是一个伤口响应基因，与GhEPS15一起在植物SAR的调节中发挥积极作用。GhMLP423诱导GhEPS15的表达，进而引发棉花植株损伤诱导的Ca2+信号。Ca2+信号的激活作为第二信使，诱导ROS积累，进而诱导SA和PR蛋白的产生，激活SAR介导昆虫抗性。

图6

图7

华中农业大学博士生孙琳 (目前已入职山东省农科院工作)和博士后Muna Alariqi为该论文的共同第一作者，华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室、洪山实验室PI张献龙院士和金双侠教授为该论文的共同通讯作者。研究工作得到了国家杰出青年自然科学基金、生物育种重大专项、湖北洪山实验室等项目的资助。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202306157

审核人 金双侠