南湖新闻网讯（通讯员 胡少强）近日，我校园艺林学学院、果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室康春颖教授课题组在Genome Research期刊发表题为“Global characterization of somatic mutations and DNA methylation changes during vegetative propagation in strawberries”的研究论文。该论文选用森林草莓茎尖组织培养再生植株和栽培草莓主栽品种‘红颜’的12个单株，通过全基因组DNA变异和DNA甲基化变异分析，揭示了草莓在组织培养和营养繁殖过程中的体细胞变异特征。

草莓果实美味可口、营养丰富，是在世界范围内广泛种植的一种重要水果。在草莓生产过程中，夏季通过匍匐茎繁育种苗，秋季定植生产，每年轮回一次。这种营养繁殖方式导致病毒在植株体内逐渐积累，严重影响产量和果实品质。为了解决这个问题，产业上主要采用匍匐茎茎尖进行组织培养获得脱毒苗，从而恢复和保持原株优良性状。然而，在组织培养和营养繁殖过程中不可避免地会产生体细胞变异，有时导致减产或绝收，严重损害了种植户利益，造成重大经济损失。因此，探索草莓组织培养和营养繁殖过程中的体细胞变异规律具有重要产业价值。

栽培草莓是8倍体，基因组较为复杂。本研究利用基因组更简单、质量更高的2倍体种森林草莓，模拟栽培草莓组培脱毒技术流程，采集匍匐茎茎尖进行组织培养，设置两种激素浓度和两个培养时间（55天和425天），以及叶片切割后经愈伤组织产生的再生苗，获得共计5种再生植株，分别简称为LS（低浓度，短时间）、HS（高浓度，短时间）、LL（低浓度，长时间）、HL（高浓度，长时间）和CA（经过愈伤组织阶段）。这些再生植株的生长状况良好，与原始植株（CK）没有显著形态差异。

图1 森林草莓组织培养实验设计和再生植株形态

基因组重测序数据分析显示，6641个突变位点中只有3个纯合，其余都是杂合；与原始对照植株相比，每个再生植株的突变频率在3.72 × 10−8 ~ 3.07 × 10−6之间，SNV突变频率远大于InDel。每种再生植株中92%以上突变位点仅特异存在于一个单株中，说明突变位点的产生具有较强随机性。随着激素浓度与培养时间的增加，SNV突变频率显著增加，而InDel没有显著差异，表明SNV是主要突变类型，且绝大多数突变位点在染色体上均匀分布。在SNV突变位点中，C:G→T:A和A:T→T:A是主要类型，3’方向为T碱基的突变频率显著大于其他类型。基因间区和重复序列区域的突变频率略大于基因区域，而不同类型转座子之间的突变频率没有显著差异，说明DNA序列变异没有区域偏好性。

图2 森林草莓再生植株的DNA序列变异特征

对CK、HS、HL、CA和HL_rep5_R1（HL_rep5的自交后代）进行全基因组甲基化测序，分析发现在HL和CA样品中CG甲基化水平相比对照下降0.71%到8.03%，而CHG和CHH甲基化水平变化不稳定。在差异甲基化位点中，CG位点倾向于出现低甲基化，CHG和CHH位点倾向于出现高甲基化；随着组培时间的延长，hypoCG-DMR数量显著增加，并且具有很强的个体特异性。CG-DMR聚类分析发现CK和HS聚在一起，而HL和CA样品与前两者差别较大。对HL个体自交后代分析发现，78.1%的CG-DMR能够稳定遗传到下一代，显著高于CHG-DMR（48%）和CHH-DMR（58.7%）。

图3 森林草莓再生植株CG-DMR的变异特征

自1999年引入以来，‘红颜’（Beni hoppe）草莓一直受到种植户和消费者青睐，是我国第一大主栽品种，也是衍生品种最多的草莓。为了探究红颜草莓体细胞变异规律，我们首先选取一株红颜草莓进行了基因组测序与单倍型基因组组装，获得了单倍型基因组Hap1（全长784.96 Mb）和 Hap2（全长789.17Mb），将两个单倍型基因组中最好的Contig序列进行拼接形成最终基因组序列，命名为FaBen，全长798.77 Mb，包含116,232个蛋白编码基因。两套单倍型基因组间存在4,903,553个SNVs和907,768个InDels，结构变异中duplicated和inverted duplicated两种类型数量最多。

图4 ‘红颜’基因组组装及两单倍型间的变异信息

为了检测‘红颜’生产苗的个体差异，我们在湖北、河南、山西、安徽、山东、江苏等地随机收集了不同红颜草莓单株11个，并分别进行基因组重测序，发现每个单株包含4731到6005个变异位点，基本为杂合变异（99.9%）且大部分为单株特有，变异频率为6.14 ~ 7.76 × 10−6。另外，在4个亚基因组中，A亚基因组变异频率最低，C亚基因组变异频率最高，表明体细胞变异具有一定亚基因组偏好性。

图5 12株红颜个体的DNA 变异特征

综上所述，本研究严格比较了各种组培条件下草莓再生植株和不同红颜草莓个体的全基因组序列变异特点，揭示了草莓组织培养和营养繁殖中产生的DNA序列变异和DNA甲基化变异规律，为草莓体细胞变异调控提供了数据支撑，并为其他果树的体细胞变异研究提供了参考。

华中农业大学园艺林学学院康春颖教授、湖北省农业科学院韩永超研究员和曾祥国副研究员为该论文的通讯作者，博士研究生胡少强为第一作者，硕士研究生刘雨果、海南大学园艺学院李永平副研究员、中科院武汉植物园博士研究生曲明昊、华中农业大学信息学院焦文标教授参与了本研究。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和湖北省种业高质量发展资金项目项目的资助。

审核人：康春颖

论文链接：https://genome.cshlp.org/content/early/2024/10/10/gr.279378.124

原文摘要：Somatic mutations arise and accumulate during tissue culture and vegetative propagation, potentially affecting various traits in horticultural crops, but their characteristics are still unclear. Here, somatic mutations in regenerated woodland strawberry derived from tissue culture of shoot tips under different conditions and 12 cultivated strawberry individuals are analyzed by whole genome sequencing. The mutation frequency of single nucleotide variants is significantly increased with increased hormone levels or prolonged culture time in the range of 3.3× 10-8 - 3.0 × 10-6 mutations per site. CG methylation shows a stable reduction (0.71%-8.03%) in regenerated plants, and hypoCG-DMRs are more heritable after sexual reproduction. A high-quality haplotype-resolved genome is assembled for the strawberry cultivar “Beni hoppe”. The 12 “Beni hoppe” individuals randomly selected from different locations show 4731-6005 mutations relative to the reference genome, and the mutation frequency varies among the subgenomes. Our study has systematically characterized the genetic and epigenetic variants in regenerated woodland strawberry plants and different individuals of the same strawberry cultivar, providing an accurate assessment of somatic mutations at the genomic scale and nucleotide resolution in plants.